1. ActivitEs de recherche

1.1. Etude du cycle cellulaire de la levure

Lors de mon stage de DEA, j’ai participé avec l’équipe de Carl Mann au CEA de Saclay à l’identification de la kinase Cak1. Cette kinase est responsable de l'activation de la « kinase dépendante des cyclines » Cdc28 chez la levure Saccharomyces cerevisiae. J’ai isolé les premiers mutants de cak1 déficients dans la fixation de l’ATP et montré que la protéine Cak1 est une kinase responsable de la phosphorylation activatrice de Cdc28 in vitro³. J’ai montré que les kinases Cak1 forment une nouvelle famille particulière de kinases spécifiques aux champignons. Ce qui en fait une cible thérapeutique de choix dans les infections fongiques. Ces travaux ont permis à la société Aventis d'isoler des composés ayant des propriétés antifongiques.

Afin d'étudier les processus cellulaires régulés par Cak1, j’ai isolé des mutants thermosensibles de cette kinase. J’ai observé un phénotype hyperpseudohyphale des mutants cak1. En effet, les cellules de levure subissent des transformations morphologiques en réponse à divers signaux environnementaux. Un tel événement, appelé différenciation pseudohyphale intervient lorsque les cellules diploïdes sont carencées en azote en milieu agar solide. Les cellules carencées s’allongent et une fraction forme des filaments qui pénètrent dans l’agar. Les bases moléculaires des changements de la morphologie cellulaire et du cycle cellulaire en réponse à une carence en azote sont très peu définies, en partie parce que les conditions de croissance hétérogènes des cellules carencées en milieu agar solide ne sont pas maniables pour les analyses biochimiques. J’ai conçu un appareil proche du chémostat en milieu liquide pour réaliser les premières études biochimiques de la différenciation pseudohyphale et plus spécifiquement la régulation du cycle cellulaire des cellules pseudofilamenteuses.

1.1.1. Contrôle de la morphologie cellulaire par le cycle cellulaire

Les bases moléculaires des transformations de la morphologie cellulaire de la levure au cours de la différenciation pseudohyphale en réponse à divers signaux sont très peu connues. J’ai mis au point un système proche du chémostat permettant d’étudier la différentiation pseudohyphale pour montrer que ces changements morphologiques de la cellule sont étroitement liés aux modifications du cycle cellulaire. Ce dernier dépend des oscillations de l'activité de Cdk1. Cette activité est régulée par la fixation des cyclines et une phosphorylation activatrice par la kinase Cak1¹.

J’ai montré que les niveaux des cyclines Clb1 et Clb2 sont réduits en milieu liquide carencé en azote en chémostat comparés aux cultures en milieu riche. D’autre part, le répresseur transcriptionnel des cyclines B, Xbp1 est très fortement induit dans ces conditions. En outre, la délétion du gène XBP1 inhibe l’élongation cellulaire et la différentiation pseudohyphale. Ces résultats montrent que XBP1 est essentiel à la différenciation pseudohyphale. La délétion de la cycline CLB2 rétablit l’élongation cellulaire et la pseudofilamentation du mutant délété pour XBP1 en réponse à une carence en azote. Ainsi l’activation transcriptionnelle de XBP1 et conséquemment la répression de l’expression des cyclines mitotiques de type B sont une réponse clé des cellules de S. cerevisae à une carence en azote^1,2. (Miled et al. « Xbp1-mediated répression of clb gene expression contributes to the modifications of yeast cell morphology and cell cycle seen during nitrogen-limited growth ». Mol Cell Biol. 2001).

1.1.2. La kinase Cak1 régule la transcription

Nous avons réalisé des cribles de "létalité synthétique"; cette approche consiste à isoler des gènes mutants qui provoquent la mort cellulaire des souches de levure préalablement mutées dans le gène cak1. Par ailleurs, les mutations ne sont pas létales lorsqu'elles sont indépendantes. Cette approche génétique nous a permis d'identifier trois gènes appartenant au complexe PAF1 s'associant à l'ARN polymérase II. Nos études génétiques montrent que la régulation de la machinerie de transcription par la kinase Cak1 passe via les kinases Ctk1 et Bur1⁴. (*Ganem, *Miled et al. « Kinase Cak1 functionally interacts with the PAF1 complex and phosphatase Ssu72 via kinases Ctk1 and Bur1 ». Molecular Genetics and Genomics. *Co-premiers auteurs. 2005 and 2006).

1.1.3. Isolement des phosphatases de la kinase Cdc28

J’ai développé une approche génétique pour isoler les phosphatases responsables de la déphosphorylation de la kinase Cdc28 et participant ainsi à la régulation des complexes Cdc28-cyclines. Cette approche a permis d'isoler les gènes PTC2 et PTC3 codant pour les phosphatases de Cdc28. Ces résultats sont en accord avec les résultats publiés dans la revue "Genes and Development" plus tard par un autre groupe ayant isolé par une approche biochimique ces mêmes phosphatases⁵.

Mes travaux de thèse constituent une contribution importante à la compréhension des bases moléculaires de la régulation de la morphologie des cellules et des modifications du cycle cellulaire en réponse à des variations des conditions environnementales chez les levures S. cerevisiae et C. albicans. Les résultats obtenus ont déjà permis la publication de deux articles et devraient encore permettre la publication d’au moins un troisième article.

1.2. Identification de genes cibles de p53 et Etude des rEseaux genetiques regules par p53

1.2.1. Identification de nouveaux gènes cibles de p53 par génomique inverse

Le facteur de transcription p53 joue un rôle prééminent dans le contrôle de la tumorigénèse. Nous avons établi une carte génomique des sites de fixation de p53 chez l’homme et identifié des gènes candidats. J’ai réalisé des études fonctionnelles sur les nouvelles cibles transcriptionnelles potentielles de p53. Cette approche systématique combinée à la technique d’immunoprécipitation de la chromatine a permis d’identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles directes de p53, il s’agit des facteurs proapoptotiques BCL-G et MAP4K4, et COL18A1 codant pour le précurseur du facteur anti-angiogénique, l'endostatine. L’angiogénèse est une étape critique dans la progression tumorale. BCL-G appartient à la famille BCL2 et MAP4K4 est une kinase activatrice de la voie JNK. Les kinases JNK activent les facteurs proapoptotiques de la famille Bcl2. Ainsi, une boucle de rétrocontrôle positive se met alors en place et amplifie l’action pro-apoptotique de p53. La carte génomique des sites de fixation de p53 influencera les futures études des systèmes biologiques et la compréhension des réseaux génétiques de l’ère post-génomique⁶. (Miled et al. « A genomic map of p53 binding sites identifies novel p53 targets involved in an apoptotic network ». Cancer Research. 2005).

1.2.2. Régulation de p53 et mdm2 par les kinases JNKs

J’ai montré que des cellules de souris double « knockout » pour les deux gènes codant pour les protéines kinases JNK1 et JNK2 présentent un niveau protéique très élevé de l’ubiquitine ligase mdm2 et de p53. Mdm2 est une cible transcriptionnelle de p53, elle joue un rôle important dans la dégradation de p53. Mdm2 possède une activité d’autoubiquitination induisant sa propre dégradation⁷. J’ai complémenté des cellules déficientes en JNK1 et JNK2 par le gène sauvage JNK2 et observé une diminution du niveau protéique de mdm2. D'autres travaux ont montré que p53 est stabilisée en réponse à des signaux proinflammatoires⁸ et que la voie JNK est activée en réponse à l’activation des récepteurs Toll-like (TLRs)⁹.

J’ai montré que l’incubation de monocytes humains avec un ligand du récepteur TLR4 en présence de TNF alpha induit une atténuation de la production des cytokines proinflammatoires dépendante du facteur de transcription NF-kB. Ces résultats sont inattendus, en effet : le LPS et le TNF alpha sont des inducteurs puissants de la réponse proinflammatoire. J’ai proposé que la stimulation continuelle de la voie NF-kB par des signaux provenant d’un pathogène ou ses dérivés via TLR4 et de l’organisme via le récepteur au TNF alpha induisent une action anti-inflammatoire (par exemple dans des granulomes tuberculeux). Mes résultats préliminaires suggèrent que la voie JNK/mdm2 serait impliquée dans ce processus. (Un article est en préparation, Miled et al. « JNK is required for termination of toll-like receptor responses »).

1.3. Regulation de l’hematopoiese par les pathogènes chez les mammiferes

1.3.1. Identification d’un progéniteur hématopoïétique spécifique des macrophages/DC

Nous avons isolé et caractérisé un progéniteur murin commun spécifique des macrophages et DC ou MDP au niveau clonal in vitro et après transfert adoptif in vivo. Ce nouveau progéniteur exprime le récepteur des cellules souches c-kit et la chimiokine CX3CR1 visualisée après insertion de la GFP au locus de CX3CR1. Nos études ont montré que ce progéniteur est une sous population du progéniteur myéloïde et représente 0,5% de l'ensemble des cellules nucléées de la moelle osseuse chez la souris. Nous avons montré que les progéniteurs peuvent se différencier et produire les populations de macrophages et les DCs de l'état basal in vivo¹⁰. (Fogg, Sibon, Miled et al. « A clonogenic mouse bone marrow progenitor specific for MF and DC ». Science. 2005/6).

13.2. Caractérisation de deux sous populations de monocytes humains

J’ai montré que les deux sous-populations CD14 et CD16 de monocytes humains expriment différents récepteurs Toll-Like ou TLRs et répondent à différents motifs microbiens. J’ai montré que les sous populations de monocytes CD14 et CD16 sont spécialisées dans la production de l’IL-8 et du TNFa respectivement. Des coupes histologiques de granulomes inflammatoires non-infectieux et d’abcès intestinaux ont montré l’accumulation de monocytes CD16 et de monocytes CD14 respectivement. Mes résultats sont en faveur du modèle suivant : d’une part, la sous-population CD14 serait impliquée dans la réponse aux infections en sécrétant la chémokine IL8 responsable du recrutement des polynucléaires et la formation des abcès. D’autre part, la sous-population CD16 serait impliquée dans la formation de granulomes inflammatoires non infectieux en sécrétant le TNFa. (Un article est en préparation. Cros and Miled « Subsets of human monocytes express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens »).

13.3. Rôle des TLRs dans la différenciation hématopoïétique

Les maladies infectieuses sont caractérisées par une modulation de l’hématopoïèse. L'hypothèse actuelle postule que les agents pathogènes induisent la production de cytokines et de leurs récepteurs et qui seraient responsables du contrôle de l’hématopoïèse. Mes résultats montrent que l’ensemble des TLRs est exprimé dans les progéniteurs hématopoïétiques murins et en particulier les MDP. L’incubation de MDP murins ou de monocytes humains avec des dérivés de pathogènes bien spécifiques provoque une différenciation de types macrophages ou DC. J’ai proposé que l’activation des voies dépendantes des TLRs suite à des interactions directes entre les cellules souches de la moelle osseuse, les progéniteurs intermédiaires, les monocytes et les agents pathogènes ou les produits dérivés de ces agents pathogènes, module l’hématopoïèse. Des travaux d’autres laboratoires ont abouti aux mêmes conclusions et ont montré l’importance des voies TLRs dans la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques murins et les monocytes humains et publiés un peu plus tard dans les revues "Immunity"¹¹ et "Nature Medicine"¹² respectivement.

1.4. GEnEtique inverse des virus A ARN nEgatif dans la levure

L’émergence et la réémergence des infections virales et plus spécifiquement des virus à ARN négatif constituent une véritable menace pour la santé publique et nécessitent le développement rapide de nouvelles stratégies de lutte antivirale. Ces virus sont à l’origine de maladies graves telles que la rougeole, la grippe ou les fièvres hémorragiques. Les structures ribonucléoprotéiques ou RNPs forment des complexes autoréplicatifs¹³. Elles ne contiennent pas l’enveloppe virale ni les glycoprotéines de surface qui sont la cible de la neutralisation par les anticorps passifs. Ces anticorps sont d'origine maternelle dans le cas de la rougeole et sont responsables des difficultés à vacciner le très jeune enfant contre la rougeole¹⁴. Après un cycle infectieux, les RNPs sont capables de reproduire intégralement le virus vaccinal. Le développement d’une nouvelle approche de vaccination utilisant les RNPs virales infectieuses serait une avancée importante en vaccinologie antivirale. Cette nouvelle stratégie vaccinale pourrait être utilisée malgré la présence d’anticorps passifs et permettrait d'immuniser contre des antigènes conservés ou/et des antigènes additionnels (vecteur vaccinal multivalent). La réussite de ce nouveau type de vaccination dépend de la disponibilité industrielle des RNPs. Pour obtenir un niveau industriel de production des RNPs, j’ai utilisé la levure S. cerevisiae qui constitue un modèle et un outil de choix pour la recherche fondamentale et le développement de médicaments¹⁵.

Nous avons montré que les RNPs purifiées à partir de cellules de mammifères du virus recombinant « West Nile » - rougeole sont infectieuses et immunogènes chez la souris. Les animaux immunisés ont été éprouvés par des doses mortelles du virus « West Nile ». Seuls les animaux vaccinés avec les RNPs ont été protégés de l’infection mortelle¹⁶. J’ai développé une stratégie génétique permettant la réplication des RNPs du virus de la rougeole dans la levure. La stratégie expérimentale a consisté à établir une souche de levure exprimant les protéines virales N, P et la polymérase L du virus de la rougeole. Ces trois composantes sont nécessaires et suffisantes pour permettre la réplication virale dans les cellules humaines. Pour démontrer que ces constituants sont fonctionnels dans la levure, j’ai conçu différents minigénomes permettant d’analyser l’activité transcriptionnelle et réplicative associée aux RNPs chez la levure. Les minigénomes contiennent uniquement un gène rapporteur flanqué par les séquences régulatrices de la transcription/réplication virale. J’ai montré que la réplication et la transcription d’un minigénome rougeole sont possibles dans la levure et sont strictement dépendantes des facteurs viraux. Ainsi, j’ai apporté « la preuve du concept » de la réplication de particules virales des virus à ARN négatif dans la levure. J’ai mis au point une méthode génétique qui a permis de montrer que la réplication d’un génome complet du virus de la rougeole codant pour l’ensemble des protéines virales est possible dans la levure. En effet, j’ai généré une souche de levure capable d’exprimer stablement et indéfiniment des RNPs complètes du virus de la rougeole. Finalement, j’ai montré que les RNPs purifiées à partir de la levure sont infectieuses sur des cellules humaines en culture¹⁶.

Cette nouvelle approche permet le deéveloppement d’une nouvelle génération de vaccins utilisant les RNPs produites dans la levure ; les vaccins ribonucléoprotéiques. Le vaccin ribonucléoprotéique représente une alternative importante aux vaccins traditionnels. Cette technologie permettra l’identification de nouveaux gènes hôtes impliqués dans la réplication virale et la recherche d’antiviraux. Mon objectif est d’améliorer notre compréhension des bases physiopathologiques des maladies virales et notamment les mécanismes impliqués dans la réplication virale, les interactions virus-hôte ainsi que le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales. Je propose d’utiliser la levure comme modèle et outil pour étudier les virus à ARN négatif et plus spécifiquement les virus de la rougeole et de la grippe. Les résultats de ces travaux ont fait l’objet de dépôt d’un brevet international¹⁷.

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